【摘要】目的用D-gal建立大鼠急性肝损伤模型，观察肝损伤后再生过程中肝卵圆细胞的增殖和迁延。方 法建立大鼠急性肝损伤模型，于第1、3、7和14天分别取肝组织，分别行病理、免疫组织化学，观察卵圆细胞的分 布迁移情况，并取第7天肝组织进行组织电镜观察汇管区新增生细胞超微结构。结果病理切片显示肝细胞变性 坏死程度以第7天和第14天为主，出现新增生的细胞。免疫组化示随时间阳性细胞明显增多，分布于汇管区，并 向小叶中心迁移，形成大量的胆小管，并有部分向坏死区迁移。透射电镜有新生内源性细胞，小于成熟的肝细胞， 细胞器较少，有细胞紧密连接，以数个细胞排列成小胆管，与免疫组化一致。结论在大鼠急性肝损伤时HOC被 活化、增殖，并向肝小叶中心迁移，全程参与了肝再生过程.
【关键词】急性肝损伤;肝卵圆细胞;增殖;迁延
Proliferation and Protraction of Hepatic Oval Cell during Acute Liver Injury Induced by D-gal in Rat
【Abstract】Objective To establish a rat model with the combination of D-galactosamine(D-GalN)，and to observe the protraction and proliferation of oval cells during liver regeneration following hepatic damage.Methods D- galactosamine was injected to abdominal cavity in the rat so as to duplicate liver injury model.After rats were put to death on 1，3，7 and 14 days respectively，distribution and migration of OV6 positive cells were tested by tissue immunohistochemistry and finally ultrastructure of new proliferating cells was observed by transmission electron microscope in the converge duct.Results Pathological section and immunohistochemistry results showed that HOCs gradually migrated from hepatic lobule in the portal vein to liver and confluent with normal liver cells board.OV6 positive cells were moderately increased in number by the tissue immunohistochemistry and even developed into a number of gallbladder tubules，some of which crawled into necrosis areas.Moreover，the new cells with less organells，smaller than the mature liver cells in size，lined up to form small bile duct under thetransmission electron microscope，which displayed similarities to the findings by immunohistochemistry.Conclusion HOC can be activated and proliferated following liver damage and it is involved in liver regeneration.
【Key words】Acute liver injury;Hepatic oval cell;Proliferation;Protraction干细胞是一类无限期在体内整个生命活动中 有自我更新能力的细胞。在适当条件下或给予适 当信号，干细胞可分化为具体不同来源的细胞 ［1－6］ .
其中，肝脏干细胞是近几年研究的热点，由于其来 源于自体而没有移植后的免疫排斥反应，是合适的 肝脏损伤后肝衰竭的移植物并有望成为一种新的
临床方法。肝脏内的成体干细胞就是肝卵圆细胞， 本实验探讨大鼠急性肝损伤模型中，肝损伤后再生 过程中肝卵圆细胞的增殖和迁延，为肝脏修复机制 提供可能的机制.
1材料和方法 1.1材料 Wistar大鼠10只购于军事医院科学院动物所， 体重120±20 g。D-胺基半乳糖(D-Gal)购买于重 庆医科大学，批号:951124。小鼠抗大鼠OV6单克 隆抗体(北京中杉金桥生物技术公司);免疫组化试 剂盒(福州迈新生物技术公司);DMEM/F12(1∶1)、 H-DMEM(美国Gibco公司).
1.2方法 Wistar大鼠10只，雌雄不限，用D-gal腹腔注 射，调整文献中D-gal剂量，每只大鼠腹腔注射400 mg/kg。分别于注射D-Gal后第l、3、7、14天，将大 鼠处死，行病理、免疫组织化学，观察卵圆细胞的分 布迁移情况，并取第7天肝组织进行组织电镜观察 汇管区新增生细胞超微结构.
2结果(图1～7，见彩插Ⅱ) 2.1病理变化 D-gal腹腔注射24 h常规病理切片见肝细胞变 性、糖原消失及局灶性炎性浸润，部分肝细胞破裂， 门脉区出现少量炎性细胞浸润(图1)。3 d时肝细 胞变性坏死，炎性细胞浸润，以门管区显著。7 d时 汇管区卵圆形细胞增多，并出现少量新生的小胆管 及肝细胞(图2)。14 d时汇管区出现大量增生的卵 圆形细胞，并形成较多新生胆管，向肝小叶迁移(图 3).
2.2组织免疫组化OV6的表达 组织免疫组化观察OV6表达，发现第1天在汇 管区仅有少量表达(图4)，第7天在汇管区阳性细 胞大幅增加，并新生的小胆管明显较对照组增多， 并开始向肝实质内迁移(图5)，第14天上述阳性细 胞广泛分布于肝小叶中，参与了肝脏的修复(图6).
www.yixueda.com 医学论文网 2.3肝组织透射电镜观察 取第7天大鼠肝组织，透射电镜结果发现汇管 区有较多的新生细胞，大小约7～15μm，胞核大，核 圆形或卵圆形，胞质相对较少，胞质内较少细胞器 (图7).
3讨论 肝卵圆细胞被认为是肝脏的干细胞，在肝脏中 数量极少，但是，当肝脏受到损伤时，可以大量的增 殖，并能够修复部分损伤的肝细胞，暂时替代肝脏 的功能 ［7－12］ 。本实验对D-gal造成的急性肝脏损伤 时肝卵圆细胞的活化增殖进行研究，探讨肝脏损伤 时可能的干细胞替代治疗途径.
3.1肝损伤模型制备 目前，有以下几类肝损伤模型的建立方 法 ［13－15］ :(1)化学性肝损伤动物模型，如四氯化碳 性肝损伤;D-氨基半乳糖性肝损伤;醋氨酚性肝损 伤。(2)免疫性肝损伤动物模型，如卡介菌加脂多 糖诱导法;丙酸杆菌或痤疮丙酸杆菌加脂多糖诱 导;刀豆蛋白A诱导法。(3)酒精性肝损伤动物模 型，如急性酒精性肝损伤;慢性酒精性肝损伤。(4) 外科手术动物模型，主要有三种:肝缺血模型、部分 肝切除模型、全肝切除模型等。在本实验中，我们 选择了D-gal来作为大鼠肝脏损伤模型，D-gal用法 是用生理盐水配制成100 g/L，并用1 mol/L氢氧化 钠(NaOH)调节其pH值至7.10。但造成肝损伤的 剂量，国内、外报告差别较大(100 mg/kg～2300 mg/kg) ［16－20］ ，大鼠或小鼠1次性腹腔注射600～ 900 mg/kg，也有人连续两次，间隔24 h，造成急性肝 损伤模型，染毒24～48 h后处死动物，检查肝功、 病理及脂质过氧化等有关指标 ［21－23］ 。在继Dixit、 Blitzer等成功建立实验动物鼠和兔的D-gal诱导的 肝损伤模型后，有学者成功制备大动物犬的D-gal 模型 ［24－26］ .
本实验在预实验的基础上，发现给大鼠400 mg/kg的D-gal即可使大鼠的肝脏受到中等程度的 损伤，且不会导致大鼠的死亡，其操作可靠，重复性 较强，肝损伤一致性较好.
3.2肝卵圆细胞增殖和迁延过程 有研究者为诱导大鼠肝脏卵圆细胞，连续给予 低浓度的2-乙酰氨基芴(2-AAF)抑制肝细胞的增 生，在处理中期(7～10 d)，实施肝2/3切除术，由 于肝细胞大量丢失，肝细胞生长反馈信息缺失导致卵圆细胞的快速生长。卵圆细胞先出现在胆管周 围，然后有些迁移入肝实质。通过病理切片发现， 汇管区有卵圆形细胞的增殖，随着实验的进展，卵 圆形细胞向肝小叶内迁移，在第14天时，肝卵原细 胞已经散布在肝实质内，代替损伤的肝细胞修复肝 脏。而免疫组化OV6也证实了增殖的体积稍小的 细胞是卵圆细胞。透射电镜发现发现汇管区有较 多的新生细胞，大小约7～15μm，胞核大，核圆形 或卵圆形，胞质相对较少，胞质内较少细胞器。我 们的实验结果证实，肝卵圆细胞始终贯穿于肝脏修 复的全过程，可以为急性肝衰竭进行暂时的支持， 对
临床有积极的意义.
肝干细胞的分裂增生方式被认为是一种不对 称增生，在子代2个细胞中，一个保持干细胞的特 性，另一个分化成组织细胞，参与组织损伤修复.在 正常肝脏，肝干细胞处于休眠期，不分裂增生。当 肝干细胞被激活后，必须在适宜的微环境中才能分 化成熟。故我们认为 ［27－29］ ，肝脏损伤后修复的方式 可能如下:大鼠损伤肝脏早期就有小部分卵圆细胞 被激活，初步参与了肝脏的修复，但是由于数量太 少，无法完全修复损伤肝脏，因而，病理表现肝细胞 坏死、炎性细胞浸润等改变，随
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