【摘要】目的研究制备人鼠肝组织嵌合小鼠模型。方法将人骨髓干细胞直接注射到一定日龄胎鼠肝组 织，每只注射移植约1×109人骨髓干细胞。用免疫组化对出生一定日龄移植小鼠肝脏进行甲胎蛋白免疫组织化 学检测，检定分析人肝细胞在小鼠体内嵌合生长情况。结果移植人骨髓干细胞胎鼠出生2月龄、12月龄可检测 到甲胎蛋白。结论将人骨髓干细胞移植小鼠肝脏内能够存活并分化成人肝细胞并能够长期存活.
    【关键词】人鼠嵌合;甲胎蛋白
 The Preliminary Investigation of Human-mouse Liver Chimeric Model Preparation     【Abstract】Objective To establish the human mouse chimeric model of HCV.Methods The human bone marrow stem cells were transplanted into each mouse with the number of 1×10 9 via liver to fetal mouse in KM mouse.
    Testing the AFP in the transplanted mouse liver by immunohistochemistry to analyze the living condition of human liver cell in the mouse body.Results AFP was tested after the transplantation of months within its normal value.Conclusion The human bone marrow stem cells can live and differentiate into the liver cells after transplantation into mouse liver.
    【Key words】Human-mouse chimeric;AFP 病毒性肝炎是严重危害人类健康的传染性疾 病，长久以来一直面临缺少稳定可靠的感染细胞模 型和动物模型此大难题，阻碍了对HBV、HCV致病 机制、抗病毒药物筛选和疫苗研究等的研究进程.
    近年来随着新的生物技术的迅速发展，小鼠肝脏嵌 合人肝细胞将为人类针对人体肝脏疾病和肝细胞 病毒的研究提供绝佳的体内模型 ［1］ 。我们以KM小 鼠作为受体，通过肝脏对胎鼠移植人骨髓干细胞， 使人的骨髓干细胞诱导胎鼠产生免疫耐受可在小 鼠肝脏内长期存活，使人的骨髓干细胞在小鼠肝脏 内增殖，探讨建立一种制备人肝组织的嵌合体动物 模型可能性，从而制备丙型病毒肝炎感染模型.
    1材料和方法 1.1实验动物 KM小鼠购自南方医科大学实验动物中心，由 中心SPF实验室饲养，合格证号为2008A071;孕期 13～15 d雌性鼠为实验对象。Percoll细胞分离液购 自美国Pharmacia公司、兔抗人AFP多克隆抗体购 自Invitrogen，编号:18-0055。1.2人骨髓干细胞的移植 1.2.1人骨髓干细胞的获取:取临床无血液疾病志 愿者髋骨内骨髓，密度梯度离心法分离与贴壁法分 离人BMSCs。用血球计数板计数并计算细胞存活 率，台盼蓝担染法计算干细胞存活率，超过80%用 于实验，所得人骨髓干细胞的一般达109。获取的 人骨髓干细胞立刻进行胎鼠肝内移植.
    1.2.2胎鼠肝内移植:先后选八只孕期为13～15 d 的KM小鼠戊巴比妥钠肌注麻醉，沿小鼠腹白线逐 层剪开，暴露子宫，此时肉眼可见子宫内胎鼠，因胎 鼠皮肤未发育完全故较透明，可清晰看到腹腔内颜 色较深部位，即为肝区。用棉棒轻轻操作，用微量 进样器将预先备好的人骨髓干细胞逐个注入胎鼠 肝脏内，每只的量为5μL，并用医用棉签按压注射 点止血，注射完毕后，将胎鼠轻轻送回腹腔复位，缝 合创口。自注射后开始观察.
    1.3标本采集 对于小鼠进行活
www.yixueda.com  医学论文网体肝脏标本采集.具体方法: 先将小鼠麻醉，通过手术打开腹腔，暴露肝组织并 切取小部分小鼠肝脏组织，创面迅速灼烧止血。肝 组织固定制备成腊块备用.
    1.4检测 免疫组化甲型胎儿蛋白(AFP)简称甲胎蛋白的 检测。按照试剂盒操作说明，采用S-P法染色对小 鼠体内人肝细胞的甲胎蛋白进行特异性测定，以人 肝组织表达AFP为阳性对照.
    2结果 2.1免疫组化结果 用免疫组化检测发现，有AFP的存在。结果肝 组织中阳性细胞的AFP主要位于肝细胞的胞质内， 呈棕黄色。用免疫组化对移植人骨髓干细胞处理 获得的2月龄实验鼠肝组织人特异AFP检测，结果 鼠肝组织可见有散在AFP阳性肝细胞，主要位于肝 细胞的胞质内，呈棕黄色，表明有AFP表达;到12 月龄再次活体取肝组织进行肝组织AFP检测，鼠肝 组织仍可见到AFP阳性肝细胞，这表明嵌合的人肝 细胞可在鼠肝脏长期存在(图1，见彩插Ⅵ).
    2.2鼠肝内移植结果 本实验共注射8只孕期为13～16 d KM孕鼠， 其中只有3只孕鼠成功产仔，分别产2只、4只和4 只共计10只仔鼠，移植成功率为37.5%。其他实 验孕鼠注射后第2日或第3日流产，这主要是由于 通过子宫直接对胎鼠注射易造成较大损伤引起孕 鼠流产而失败.
    3讨论 胚胎时期肝细胞并未成熟，AFP合成量很高， 白蛋白合成量较低，仍处于幼稚状态，与成人肝细 胞存在很大差异 ［2］ 。既往研究发现移植的肝细胞 能和宿主肝实质一体化 ［3］ ，然而在正常的受体肝 脏，移植肝细胞只能显示出有限的数量增长活 性 ［4］ 。过去有关研究一般选用人肝细胞、胎肝细 胞。几年来干细胞能在正常肝脏内增殖 ［5］ 并具有 很强的增生性，还可分化成肝细胞 ［6］ ，是肝细胞移 植理想的细胞之一，所以本研究选用骨髓干细胞为 供体细胞.
    对新生小鼠移植人骨髓干细胞或肝细胞的方 法建立人鼠嵌合小鼠，是当前肝病研究的一个重要 方向。如果动物在胚胎发育时期接触到外来抗原， 它们会逐渐对这些抗原产生耐受，允许异种移植物 在体内中存活 ［7］ 。对啮齿类动物的研究结果表明， 制备理想的“嵌合肝”就要从选择人的何种细胞为 供体、何种动物为受体及二者相互作用等因素来研 究。即一方面降低宿主对移植细胞的免疫排斥和 宿主对移植细胞增殖的抑制;另一方面移植细胞有 更强的生长优势，为此我们研究对胚胎期胎鼠移植 干细胞。人肝细胞移植到小鼠后重构小鼠肝脏对 于分析代谢性或病毒性肝病的基因治疗和探讨生 物机制大有裨益 ［8，9］ .
    AFP是人体胚胎时期胎儿肝细胞和卵黄囊内 合成的一种糖蛋白，胎儿出生1～2周后迅速下降至 成人水平(0～20μg/L)。AFP的生成量和胎儿肝 脏或肝细胞再生时的分裂细胞数量呈正相关，故有 人认为AFP是由分裂增殖的肝细胞所产生，也可用 于了解肝细胞再生情况 ［10，11］ 。本实验结果显示实 验鼠在2月龄和12月龄进行人肝组织特异AFP免 疫组织化学检测，均可见有阳性细胞，证实了小鼠 体内嵌合有人肝细胞存在，且表明我们制备的人鼠 “嵌合肝”实验鼠，嵌合鼠肝组织人的细胞具有人肝 细胞特性。本实验证明了可以利用人骨髓干细胞 来制备人鼠“嵌合肝”，并这种“嵌合肝”可持续至少 12个月时间.
    参考文献: 
   ［1］Maura D，Martin R，Burda E.Repopulation of mouse liver withhuman hepatocytes and in vivo infection with hepatitis B virus ［J］.Hepatol，2001，33(4):981－988.
    ［2］王方，王小红，王宇明.HBV体外感染人胎肝细胞的鉴定方 法研究［J］.第三军医大学学报，2004，26(1):74－77.
    ［3］Gupta S，Rogler CE.Lessons from genetically engineered animal models VI.liver repopulation systems and study of pathophysiological mechanisms in animals［J］.Am J Physiol， 1999，277(6 Pt 1):G1097－1102.
    ［4］Brown JJ，Parashar B，Moshage H，et al.A long-term hepatitis B viremia model generated by transplanting nontumorigenic immortalized human hepatocytes in Rag-2-deficient mice［J］.
    Hepatolol，2000，31(1):173－181.
    ［5］Gupta S，Rajvanshi P，Aragona E，et al.Transplanted hepatocytes proliferate differently after CCl4 treatment and hepatocyte growth factor infusion［J］.Am J Physiol，1999，276(3 Pt 1):629 －638.
    ［6］蒋黎，李俊刚，兰林，等.鼠特异性Fas抗体对人鼠嵌合肝中 人肝细胞增殖的促进作用［J］.世界华人消化杂志，2008，16 ［7］Ouyang EC，Wu CH，Walton C，et al.Transplantation of human hepatocytes into tolerized genetically immunocompetent rats［J］.
    World J Gastroenterol，2001，7(3):324－330.
    ［8］Dabeva MD.Shafritz DA.Hepatic stem cells and liver repopulation［J］.Semin Liver Dis，2003，23:349－362.
    ［9］Oertel M，R