【摘要】 目的 明确国内分离的45株尿道致病性大肠埃希菌(UPEC) P菌毛的papG和papA的基因型分布状况及两者可能的组合形式，为国内UPEC菌株的致病机制、遗传变异、流行病学分析和免疫防治等研究提供基础依据。方法 应用papG 和papA 多重PCR基因分型方法对45株UPEC菌株进行papG和papA基因分型,并分析基因型分布与组合形式。结果 45株UPEC P菌毛的papG均为Ⅱ型，与国外报道显著不同。其中44株(97.8%)papA基因可成功分型，1株(UPEC4030,2.2%)不能分型，提示为未知基因型。44株papA基因分型结果阳性菌株中，11个基因型分布如下：24株(54.55%)具有单一型;13株(29.55%)具有2个基因型;4株(9.09%)和3株(6.82%)分别具有3个和4个基因型。单一基因型较为常见的为F7-2(25.00%)、F11(6.82%)和F16(9.09%)。受试菌株各种基因型出现的频次，优势基因型依次为F10和F13各12株(27.27%)、F7-2和F11各11株(25.00%)、F14为10株(22.27%)、F16为9株(20.45%)。具有2个以上基因型的组合形式与国外不同，并首次发现了4个基因型(F8+F9+F13+F14)组合的UPEC菌株。结论 国内分离的45株UPEC菌株papG高度保守，而papA呈现高度多态性，并出现与国外不同的基因型。
【关键词】
尿道致病性大肠埃希菌;P菌毛;基因分型Study on P pili genotyping of uropathogenic Escherichia coli strains isolated WU Qinggang,JIANG Yong，LI Boqing,et al.Wuxi Center for Disease Control and Prevention(Wuxi 214023,China)
Abstract： Objective To define the genotypic distribution and combination forms of papG and papA of 45 uropathogenic Escherichia coli(UPEC) strains isolated in China,and to lay a foundation of further study on pathogenesis,genetic variation,epidemiological analysis as well as immunotherapy.Methods The papA and papG genes of 45 UPEC stains were typed by the multiplex PCR assay and the genotypic distribution and combination forms of the two genes were analysed.Results Among the 45 strains,all the strains carried class Ⅱgenotypes of papG(44,97.8%)were found by the multiplex papA PCR assay(FPCR) to containing one or more of 11 known papA alleles(Ftypes).Only one strain(UPEC4030) was negative according to FPCR assay and by PCR.Hence,it was suspected of harboring novel variant of papA.Of the FPCR positive strains,24(54.55%)had a single F types,13(29.55%)had two types,4(9.09%) and 3(6.82%) had three and four types.F72(25.00%),F11(6.82%)and F16(9.09%)tended to occur alone.Among the 11 known F types,nine F types occurred at least once in the population in decreasing order of prevalence as follows:F10 and F13(27.27%),F72 and F11(25.00%),F14(22.27%),F16(20.45%).The combination forms with more than 2 papA genotypes were different from those found abroad.The strains containing four F types(F8,F9,F13 and F14)were found for the first time.Conclusion The results suggested that the papG sequences of UPEC strains isolated in China were highly conservative and the papA sequences possessed polymorphisms.The 45 UPEC strains isolated had different papA genotypes from those found outside China and their clinical and epidemiological meaning need further study.
Key words： uropathogenic E.coli;P pili;genotyping 大肠埃希菌是尿路感染的主要致病菌，85%以上的菌株具有P菌毛，P菌毛能特异性地粘附、定植于人泌尿道上皮细胞，进而引起尿道上行性感染，这类菌株称为尿道致病性大肠埃希菌(Uropathogenic E.coli，UPEC)〔1〕 。P菌毛包括2种蛋白,其中P菌毛尖端PapG粘附素是UPEC粘附定植的关键因子，人类特有的PapG依其受体结合特异性不同分为Ⅰ、Ⅱ 2种血清型;Ⅰ、Ⅱ型PapG粘附能力不同，因此，其菌株致病性也有差别〔2〕 。另1种蛋白是PapA(或称F抗原，P fimbrial Antigen)，占P菌毛蛋白总量的99.9%;PapA是UPEC血清学分型的基础，现共发现11个血清型，与血清型相对应的是11个基因型〔3〕。对于UPEC菌株的papG和papA 2个基因型的流行病学研究国外已有报道〔2-4〕。本研究应用papG 和papA多重PCR基因分型方法〔3-5〕对国内分离的45株UPEC进行papG和papA基因分型，以期明确国内UPEC P菌毛的papG和papA的基因型分布状况及两者可能的组合形式，为UPEC的致病机制、遗传变异、流行病学分析和免疫防治等的研究提供基础依据。
1 材料与方法
www.yixueda.com 医学论文网 1.1 材料 (1)菌株、质粒和培养基：分离自江苏省无锡市第二人民医院、天津医科大学总医院和第二医院、北京协和医院1992～2006年尿路感染者尿标本尿道致病性大肠埃希菌(UPEC)45株，均经常规细菌学方法鉴定，再经D-甘露糖抵抗血凝反应(MRHA)和papC PCR法双重鉴定确定为带有P菌毛菌株。(2)标准菌株：UPEC132，其P菌毛 papA和papG分别为F13型和Ⅱ型;UPECJ96为F13型和Ⅰ型papG代表株;UPEC1442为F12型papA代表株;E.coli k-12p678-54为无菌毛代表株(美国Hull RA 和de Ree JM教授惠赠)。(3)质粒：pPIL110-75、pPIL110-37、pANN921、pPIL288-10、pF-10、pPIL291-15、pCT10、pF14、pF15和pF16(美国Hull RA 和de Ree JM教授惠赠)，分别带有血清型为F7-1、F7-2、F8、F9、F10、F11、F13、F14、F15和F16的UPEC菌株染色体上编码P菌毛的粘附基因群〔3〕。(2)试剂和仪器：脂质双层(LB)固体和液体培养基(北京博大泰克公司);DNA提取设备为genomic DNA isolation kit(北京博大泰克公司)，PCR引物由上海Sangon公司合成;DNA标准分子量(大连TaKaRa公司);PE2400DNA扩增仪(美国GE公司)。
1.2 方法
1.2.1 papG多重PCR扩增 (1)根据文献〔4〕合成用于papG基因分型的2对寡核苷酸引物分别对应于该基因的5′和3′端，预期扩增papGⅠ、Ⅱ型基因中461，190bp片段。引物序列为：Ⅰ型上游：5′TCGTGCTCAGGTCCGGAATTT3′，下游：5′TGGCATCCCCCAACATTATCG3′;Ⅱ型上游：5′GGGATGAGCGGGCCTTTGAT3′，下游：5′CGGGCCCCCAAGTAACTCG3′。(2)反应体系与反应条件如下：10×扩增缓冲液5 μl,MgCl2 2 mmol/L混合4种脱氧核糖核苷酸(dNTP)200 μmol/L,混合4种引物各20 pmol,模板DNA 10 ng加双蒸水(DDW)至50 μl,混合后加入TaqDNA聚合酶2 U。预变性95 ℃ 7 min; 94 ℃ 1 min,61 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min 3个循环; 91 ℃ 1 min,63 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min 25个循环;72 ℃延伸10 min。
1.2.2 papA多重PCR扩增 (1)根据文献〔3〕合成13条寡核苷酸引物，其中F71r、F72r、F8r、F9r、F10r、F11r、F12r、F13r、F14r、F15r、F12/15r、F16r分别代表11个不同基因型papA下游引物，Ff为上游共有引物，预期扩增375，183，251，416，312，277，393，400，320，455，179，239bp片段，其中F12r和F12/15r为扩增F12型UPEC papA基因片段的3′端共同引物。引物序列如下：上游引物Ff：5′GGCAGTGGTGTCTTTTGGTG3′;下游引物 F71r：5′TTTCACCCGTTTTCCACTCG3′，产物375bp;F72r： 5′TTTGGGTTGACTTTCCCCATC3′，产物183bp;F8r： 5′GTACCACCTACAGCACTTGG3′，产物251bp;F9r：5′AAGGCCCCGTTGACGTTTT3′，产物416bp;F10r：5′CTCCTCATTATGACCAGAAACCCT3′，产物312bp;F11r： 5′GGCCCAGTAAAAGATAATTGAACC3′，产物277bp;F12r：5′CCCATCGACAAGACTTGACA3′，产物393bp;F13r：5′GGGTATTAGCATCACCTTCGGAG3′，产物400bp;F14r： 5′GCAGCATATCTTTATTGTTCCC3′，产物320bp;F15r：5′GCTACATTCTTGCCACTTGC3′，产物455bp;F12/15r：5′AATTCTTGGGCGTTGAGGATCCA3′，产物179bp;F16r：5′GTTCCCGCTTTATTACCAGC，产物239。为了
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