2006-11-20 11:27:00 关键字：  研究进展
　　1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型是现代分子生物学诞生的里程碑，开创了分子遗传学基本理论建立和发展的黄金时代。所谓分子生物学是指从分子水平研究生命现象、生命本质、生命活动及其规律。医学分子生物学是其中的一个重要分支，它是以疾病为中心，用分子理论和技术来研究人类疾病的预防、诊断、治疗和发病机制等。早在19世纪，人们就已知道结核病的致病菌是结核分枝杆菌，研究人员对结核分枝杆菌的形态、生长特性等进行了充分的研究。20世纪90年代以来，随着分子生物学在医学领域取得的飞速发展，研究者也将分子生物学的原理引入了结核病实验研究范围。因而，结核病分子生物的研究也主要是从分子水平来研究结核分枝杆菌基因组、结核分枝杆菌致病机制、结核分枝杆菌耐药性机制等，再在这些理论研究的基础上开展结核分枝杆菌分子生物学检测的研究等。本文拟在结核杆菌分子生物学理论及分子生物学技术上做简单的综述。

　　1  结核杆菌分子生物学基础理论的研究

　　1.1  结核分枝杆菌基因组  1998年英国Sanger中心和法国Paseteur研究所科学家合作完成了结核分枝杆菌H37Rv株的全基因组测序工作［1］。结核杆菌全基因组序列由4.41Mb(4.41529bp)组成，包括4411个基因，具有潜在编码能力的基因约有3977个，约占90.2%。有3924个开放阅读框，其中约40%有功能，44%可能有功能，16%称为孤独序列，与其他微生物的序列无相似性。基因组富含GC碱基，G+C含量高达65.6%。2001年10月，完成了对结核杆菌CDC1551全基因组的测序工作。结核分枝杆菌全基因测序工作的完成为结核病病原菌致病基因的各种研究提供了极好的机遇。

　　1.2  结核杆菌耐药基因的研究  20世纪中叶以来，各种抗结核药物相继问世，加之人们生活水平的提高、卫生设施的改善等，结核病的发病率持续下降。然而，结核杆菌很快对各种药物产生了耐药性，结核病在沉寂了一段时间后又死灰复燃，给结核病控制工作带来了新的挑战。从结核菌的结构本身上来讲，它具有几种抑制抗生素活性的机制。首先，它被其特有的、高疏水性的细胞壁保护，大大降低了化合物的渗透性，这就构成了结核杆菌对药物的第一道防线。另外，在结核杆菌中发现了活跃的药物外排系统、使药物降解或失活的酶以及与这些功能相关的基因。结核杆菌的耐药性形成机制有适应学说、选择学说、遗传学说，遗传学的研究表明结核杆菌产生耐药性的根本原因在于基因突变。在自然条件下，基因突变的几率非常低（一般在10-8～10-5）。其中结核杆菌针对异烟肼和利福平发生突变的几率分别为10-6和10-8，发生多耐药性突变的几率为10-14。

　　基因学研究表明，结核杆菌耐药性的产生多见于染色体上编码药物标靶的基因或药物活性有关的酶基因突变所造成。目前对结核杆菌耐药分子机制的研究主要集中在各种药物的作用靶点及其相关基因的突变上。现已研究清楚耐药性有关突变形式，有点突变、缺失、插入突变等，这些形式在抗结核一线药物（异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇、链霉素等）均已出现［2］。

　　1.2.1  结核杆菌耐利福平（RFP）分子机制  RFP作用于结核杆菌DNA依赖的RNA聚合酶β亚基（rpoβ），与它特异性地结合，抑制聚合酶活性，干扰分枝杆菌RNA的转录及合成，阻碍蛋白质合成而发挥抗菌作用。近年来的研究表明，结核分枝杆菌耐RFP的发生是由于编码RNA聚合酶聚合酶β亚基（rpoβ)基因突变所致，而且集中在一段高度保守的81bp(507～533位27个氨基酸密码子）的区域内，此区域为核心区域又称RFP耐药决定区。最常见的突变点是第531位丝氨酸（Ser)与亮氨酸（Leu)置换，第526位组氨酸（His)与络氨酸（Tyr)、天门冬氨酸（Asp)或半胱氨酸Cys置换，第516位Asp与氨酸（Val)置换。临床分离耐RFP菌株超过96%是由于rpoβ基因突变所致，其中有65%～86%的突变发生在第531位和第526位，并引发高RFP水平的耐药（＞32μg/ml），而514、521、533位点产生的都是RFP低水平耐药（＜13.5μg/ml)。约4%左右耐RFP结核分枝杆菌的核心区域或rpoβ基因其他未知未发生突变，提示还有其他耐RFP机制存在，如发现在rpoβ氨基酸终止区域的突变与利福平的耐受性有关［3］。rpoβ突变已作为结核分枝杆菌耐RFP的遗传标志，并建立了多种快速、有效的检测耐RFP基因型的方法。目前，研究人员主要研究rpoβ基因不同位点突变与耐RFP表型之间、rpoβ基因突变与利福平最低抑菌浓度的关系等。这些方面的研究还有待进一步的深入。

　　1.2.2  结核杆菌耐异烟肼的分子机制  异烟肼属于前体药物，需要由结核杆菌体内的过氧化氢酶―过氧化物酶激活，从而产生一系列的活性氧和活性有机自由基攻击结核杆菌的多个靶点，结果造成一些蛋白靶点某些基团氧化或酰化使蛋白失活，从而导致菌体一些生理功能的丧失。INH耐药机制比较复杂，目前研究比较清楚的是细胞壁分枝菌酸合成途径中的酶系［4］，过氧化氢酶―过氧化物酶编码基因（KatG)和（或）烯酰基还原酶编码基因（inhA)或烷基过氧化氢酶编码基因（ahpC)或酰基携带蛋白（AcpM)及β酮酯酰合成酶的复合物编码基因（KasA)等。

　　KatG基因位于结核杆菌染色体上，含2223个核苷酸。临床分离耐INH的菌株中有42%～58%发生了KatG基因突变［5］，可有KatG基因的完全缺失（不到1/3），导致产生高水平的INH耐药［6］；大部分为KatG基因有突变（点突变、缺失或插入）［6］，约在40%的耐异烟肼菌株中发现了第315位（Ser―Thr)的突变，此位置的突变使得过氧化氢酶―过氧化物酶丧失了近50%的酶的活性，导致酶失去活化INH的能力，引起高水平的INH耐药性，但它保留的酶活性仍为菌体提供一定水平的氧化保护，可使菌株抵抗机体残留的抗生素。KatG其他位置上的变异，也可以导致细菌对INH产生不同水平的耐药性和保留不同的过氧化物酶―过氧化氢酶活性，对这些突变所起的作用还需要深入的研究。

　　InhA和KasA均属于分枝菌酸合成系统的酶蛋白，它们发生突变的位点通常位于启动子区域，也有少数发生在编码这些蛋白的基因中，突变最终导致这些靶蛋白的过量表达或者一些功能的变化。但这类突变引起的都是低水平的异烟肼耐受［2］。InhA发生的突变使得第94位的产物色氨酸被丙氨酸取代，这种取代使InhA与还原型烟酰胺二核苷酸（NADH）的亲合力提高，从而在一定程度上阻断了异烟肼对InhA的抑制，使菌株产生了一定的耐受性。对临床耐INH菌株的研究，在一些耐药菌株上可出现KasA基因突变［2］，但在一些敏感菌株中也发现了类似的突变，目前对于它在INH耐受中起的作用还不太清楚，有待进一步的研究。

　　在约10%INH临床耐药株中含有KatG基因突变的菌株中发现了ahpC基因的突变。INH耐药菌株中ahpC启动子区域突变将引起AhpC蛋白的过量表达，从而弥补KatG基因突变造成的过氧化氢酶―过氧化物酶活性的损失，以抵抗宿主巨噬细胞的氧化作用。AhpC和KatG是细菌中协同作用调节氧压的一个调节子的两个酶，该协同作用是与OxyR转录因素一起进行的。结核杆菌OxyR基因含有许多移码突变、缺失，本质上并无活性，是一个假基因，与结核分枝杆菌INH敏感性无关［7］。但OxyR调节蛋白在功能上是作为氧化―应激的感受器和基因转录的激活剂，它控制解毒酶基因的表达，如KatG和ahpC基因的表达。因而，认为AhpC和OxyR水平之间的关系是结核杆菌对INH敏感的原因［2］。

　　1.2.3  结核杆菌耐链霉素的分子机制  链霉素是一种氨基糖苷类抗生素，它主要作用于核糖体30S亚基，诱导遗传密码的错读，抑制转译过程的开始，干扰转译过程中的校对，从而抑制蛋白质的合成，发挥抗菌作用。研究表明，结核分枝