关键字： 细胞癌
p16基因定位于人染色体9p21，编码相对分子质量为16 000的蛋白产物，作为CDK4的抑制因子，抑制细胞周期的G1～S转换。研究表明，基因的缺失是p16基因在人类多数肿瘤中失活的主要机制［1，2］，有报道p16基因在膀胱肿瘤中的缺失率仅为19％［3］，p16基因在膀胱肿瘤中是否存在其它失活机制？最近Merlo等［4］在一些较少发生p16基因缺失和突变的人类肿瘤中，如小细胞肺癌，发现高比例（78％）的p16基因5′CpG岛甲基化而失去转录活性，提示p16基因的5′CpG岛甲基化有可能参与膀胱肿瘤的形成过程。为此，本实验对p16基因在膀胱肿瘤中的失活机制进行研究，报道如下。
材料与方法
1．标本来源：标本取自天津医科大学附属第二医院泌尿外科及河南省平顶山市第一人民医院泌尿外科1995～1996年经手术切除的膀胱肿瘤标本，经病理证实为膀胱移行细胞癌。以相应瘤周正常膀胱粘膜作对照。每1例肿瘤标本分为2份'1份放入液氮冻存'另1份用4％甲醛固定'常规石蜡包埋复查病理。肿瘤分期按UICC*TNM标准'分为浅表性肿瘤原位癌～T1组共18例，浸润性肿瘤T2～4组共34例;病理分级按WHO方法'Ⅰ级13例'Ⅱ级20例'Ⅲ级19例。
2．Southern杂交及放射自显影： 应用酚-氯仿抽提法提取肿瘤组织基因组DNA，经限制性核酸内切酶Taq I完全消化，电泳并转移至硝酸纤维素膜'经典方法进行Southern杂交'p16 cDNA探针(960 bp)由美国冷泉港实验室David Beach博士惠赠。
3．聚合酶链反应-单链构象多态性分析（PCR-SSCP）分析：（1）引物设计（经微机检验符合设计要求，合成于中科院微生物研究所）：（S）：5＇-TCTGCGGAGAGGGGGAGAGCAGGC-3＇，（AS）：5＇-GCGCTACCTGATTCCAATTC-3＇，扩增包括整个外显子1在内的281 bp片段。（S）：5＇-CTGACCATTCTGTTCTCTCTGG-3＇，（AS）：5＇-CATGGTTACTGCCTCTGGTGC-3＇，扩增包括整个外显子2在内的302 bp片段。（2）实验步骤参阅文献［5］，PCR扩增仪为美国PE9600型。
4．DNA甲基化分析［5］：将大分子量基因组DNA先应用甲基化敏感性核酸内切酶（SmaⅠ）酶切，再用甲基化非敏感性核酸内切酶（XbaⅠ）酶切，电泳并转移至硝酸纤维素膜。p16外显子1探针（经PCR扩增p16外显子1产生）用随机引物法标记［α-32P］dCTP' 经典方法进行Southen杂交及放射自显影。
结 果
1．Southern杂交结果显示，p16基因为3.7 kb杂交带，2.2 kb杂交带为与p15基因的非特异杂交带（图1）。11例肿瘤存在p16基因缺失，缺失率为21.15％。p16基因的缺失与膀胱肿瘤病理分级及
临床分期的关系。
讨 论
膀胱肿瘤的自然病程还不十分清楚，因为无法确定哪一部分表浅性肿瘤将会进展成为浸润性肿瘤。
临床资料的研究表明，膀胱肿瘤可能不是通过单一途径而进展，浸润性肿瘤可能来自较少恶性进展的表浅乳头状肿瘤［6］，或来自较易侵袭转移的原位癌［7］。Spruck等［8］分析了表浅性膀胱肿瘤的遗传物质的改变，提出了浅表性膀胱肿瘤恶性进展的两个不同的分子通路：表浅乳头状肿瘤中常存在9号染色体的改变，p53基因突变少见，而原位癌中存在与浸润性肿瘤一致的p53基因的突变率，9号染色体的改变少见。由于两类肿瘤遗传物质改变的差异，表浅乳头状肿瘤很少恶性进展，而原位癌常发生浸润。而且还指出，原位癌在发展过程中一旦出现9号染色体的改变则可能发展成为恶性度更高的肿瘤。p16基因是定位于人染色体9p21区域的一个重要的抑癌基因。我们的研究结果表明，52例膀胱移行细胞癌中11例存在p16基因的缺失'缺失率为21.15%'与Spruck等［3］报道的结果相符。且p16基因的缺失多见于早期、高分化的肿瘤，而在浸润性肿瘤中少见。说明p16基因的缺失是膀胱肿瘤发展过程中的早期事件。而且在早期肿瘤中只有Ta和T1期肿瘤出现p16基因的缺失，原位癌中则未检测到p16基因的缺失。以上研究结果进一步支持了膀胱肿瘤的发生和发展可能是通过两种不同分子通路的假说。
应用PCR-SSCP技术，我们对肿瘤组织中p16基因97％（外显子1、2）的编码序列进行突变分析，结果仅发现1例肿瘤外显子2出现泳动变位。由于受PCR-SSCP本身灵敏性的限制或p16基因的突变热点可能在p16外显子1、2之外的区域，可能会漏掉对一些突变肿瘤的检测。但结合最近的研究结果，除食管癌和胰腺癌外，p16基因在人类其它肿瘤中的点突变率均很低［2，9，10］，因此，我们认为基因的点突变可能不是p16基因在膀胱肿瘤中失活的主要机制。
染色体区域性甲基化与抑癌基因的功能丢失有关，基因启动子区域5＇CpG岛甲基化常伴有基因的转录失活，p16基因外显子1启动子区域位于一典型的CpG岛。我们的研究结果表明，正常膀胱粘膜中未发现p16 5＇CpG岛甲基化存在，52例膀胱肿瘤组织中19例存在p16基因5＇CpG岛甲基化，甲基化率为36.54％。且p16基因5＇CpG岛甲基化多见于晚期、低分化的肿瘤，在早期、高分化肿瘤中少见，提示p16基因5＇CpG岛的甲基化是膀胱肿瘤发展过程中的晚期事件，在各种致瘤因素引起膀胱肿瘤发生后，一旦获得p16基因的甲基化失活'则可促进肿瘤的恶性进展。
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